Differentiation of entomopathogenic fungus Beauveria bassiana (Ascomycetes: Hypocreales) isolates by PCR-RFLP Différentiation d’isolats du champignon entomopathogène Beauveria bassiana (Ascomycetes : Hypocreales) par PCR-RFLP

Abstract

The entomopathogenic fungus Beauveria bassiana is a promising biological control agent of several insect pests in agriculture. Molecular approaches (PCR, DNA sequence analysis and PCR-RFLP) were used in our research as tools for the identification of different B. bassiana isolates. Our work consisted in identifying the 18S, ITS1, 5.8S, ITS2 and 28S regions of B. bassiana ribosomal DNA. The DNA sequences of the amplified regions showed that the 18S rDNA is the most conserved unit, with a high homology (99.5%) between the isolates studied, while the 3’ end of the 28S rDNA has a great variability, which makes it possible to differentiate the isolates. The PCR-RFLP method was used to monitor isolates of B. bassiana and distinguish them in a target pest, Lygus lineolaris. This method involved two main steps. First, PCR was used to amplify a region of the 28S gene of B. bassiana. Second, this PCR product was digested using restriction endonucleases, and the fragments produced were compared using gel electrophoresis. Because of the high specificity and sensitivity of PCR-RFLP, it was possible to discriminate between B. bassiana isolates using spores scraped from the surface of an infected insect as samples.

Keywords:

• Beauveria bassiana,
• entomopathogenic fungus,
• nucleotide sequences,
• PCR-RFLP,
• ribosomal DNA,
• 28S gene

Résumé

Le champignon entomopathogène Beauveria bassiana suscite de plus en plus d’intérêt en recherche et constitue une avenue intéressante en lutte biologique contre plusieurs insectes ravageurs en agriculture. Différentes approches (PCR, analyse des séquences d’ADN et PCR-RFLP) ont été utilisées lors de cette étude comme outils moléculaires d’identification de différents isolats de B. bassiana. Notre travail a consisté à identifier les régions 18S, ITS1, 5.8S, ITS2 et 28S de l’ADN ribosomal de B. bassiana. Les séquences d’ADN des régions amplifiées ont démontré que la région 18S de l’ADNr était la sous-unité la plus conservée, avec une homologie de 99,5 % entre les isolats étudiés, tandis que l’extrémité 3’ du gène 28S a accumulé beaucoup de variabilité et peut donc être utilisée pour différencier les isolats de B. bassiana. La technique PCR-RFLP a été utilisée pour réaliser le suivi d’isolats de B. bassiana chez un ravageur ciblé, Lygus lineolaris, et pour les distinguer. Cette méthode comprenait deux étapes. Premièrement, la PCR était utilisée pour amplifier une région du gène 28S de B. bassiana. Deuxièmement, ce produit de PCR était digéré à l’aide des endonucléases de restriction et les fragments produits ont été comparés en utilisant l’électrophorèse sur gel. En raison de la grande spécificité et sensibilité de la PCR-RFLP, il a été possible de différencier les isolats de B. bassiana en utilisant comme échantillons des spores prélevées à la surface d’un insecte infecté.

Mots clés:

• ADN ribosomal,
• Beauveria bassiana,
• champignon entomopathogène,
• gène 28S,
• PCR-RFLP,
• séquences nucléotidiques